Test IDEXX SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR

Analytické validační testy a zkoušky křížové specificity

Referenční laboratoře IDEXX na základě unikátního zpracování publikovaných genetických sekvencí viru z lidských vzorků vyvinuly nový kvantitativní test PCR k detekci viru SARS-CoV-2 (COVID-19). Nový test obstál ve všech analytických validačních zkouškách. Ověření specificity neprokázalo křížovou reaktivitu nového testu vůči běžným koronavirům, které infikují domácí zvířata. Dostupné testy RealPCR na tyto koronaviry rovněž nedetekují syntetickou nukleovou kyselinu COVID-19. Testy IDEXX RealPCR jsou vyvíjeny a realizovány na standardní platformě kvantitativního PCR v molekulárně diagnostické laboratoři v kalifornském West Sacramento. Novým testem IDEXX SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR bylo vyšetřeno více než 4000 vzorků psů, koček a koní. Vzorky pacientů jsme obdrželi v průběhu čtyř týdnů počínaje 14. únorem 2020. Vzorky použité pro vývoj a validaci testu byly získány ze vzorků poskytnutých  IDEXX Referenčním laboratořím pro respirační PCR panely. Vzorky pocházely ze Spojených států a Jižní Koreje a zahrnovaly vzorky z regionů, jako je oblast Seattlu, kde se v současné době se vyskytují případy COVID-19 u lidí. Vzorky byly souběžně testovány  třemi dalšími třemi testy v Centru pro kontrolu a prevenci nemocí  (CDC - Centers of Disease Control and Prevention.) IDEXX nyní rozšířil monitorování do Kanady a evropských zemí, včetně oblastí s vysokým výskytem COVID-19 v lidské populaci. K dnešnímu dni byly všechny testované vzorky negativní na COVID-19. 

Vývoj a analytická validace testu

Test IDEXX SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR detekuje stejný gen nukleokapsidy jako testy CDC. Tento molekulární cíl byl stanoven na základě sekvenční analýzy, která prokázala jeho vysoce konzervativní strukturu, a byl upraven podle bodu tání a analytických požadavků naší standardizované platformy. V rámci validace testu byla nejprve provedena sekvenční analýza BLAST s porovnáním více než 300 veřejně dostupných genetických sekvencí. Následně byla ověřena funkčnost testu pomocí syntetické pozitivní kontroly; i zde test osvědčil vysoký poměr signálu a šumu (a tedy dobrou účinnost při amplifikaci), reprodukovatelnost v rámci běhu i mezi běhy a vysokou korelaci. Konfirmace výsledků byla provedena současným provedením tří testů na stejných vzorcích. Tyto testy byly připraveny podle metodiky CDC z 24. ledna 2020.1,2

Křížová specificita všech čtyř testů (na SARS-COV-2) byla potvrzena pomocí pozitivních vzorků (syntetických antigenů z veterinárních koronavirů a vzorků s pozitivním nálezem (na PCR) psího respiračního koronaviru, psího a kočičího enterického koronaviru či koňského enterického koronaviru, které IDEXX získal v rámci nabídky svých diagnostických služeb. Při validaci a screeningu kvantitativního PCR byly použity tyto kontrolní mechanismy: 

  • Extrakty s negativním nálezem: všechny extrakty hodnocené jako negativní testem PCR.
  • Preanalytická kontrola kvality vzorků pomocí kvantitativního PCR testu TaqMan®, detekujícího endogenní kontrolní gen. Tuto kontrolu absolvovaly veškeré vzorky, pozitivní i negativní.
  • PCR-negativní kontroly: všechny PCR-negativní kontroly měly negativní výsledek.
  • PCR-pozitivní kontroly: všechny PCR-pozitivní (syntetické) kontroly měly pozitivní výsledek.
  • Monitorování možné kontaminace okolního prostředí: z různých míst v laboratoři PCR byly odebrány vzorky, na nichž byla zjišťována kontaminace okolí – vždy s negativním výsledkem.

Vzorky s pozitivním nálezem (na PCR) psího respiračního koronaviru, psího a kočičího enterického koronaviru či koňského enterického koronaviru, které IDEXX získal v rámci nabídky svých diagnostických služeb, prošly také screeningem ve všech testech na SARS-CoV-2. Tyto vzorky měly negativní výsledek u všech testů CDC i testu IDEXX SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR.

Metodika screeningu

Byly použity náhodně vybrané vzorky, které IDEXX získal v rámci nabídky svých diagnostických služeb k testování na viry způsobující respirační onemocnění či průjmy psů, koček či koní. V první fázi byly ke screeningu použity vzorky ze stěrů (většinou z hloubi hltanu a oční spojivky) a výkalů. Testováno bylo více než 4 000 vzorků získaných v období od 14. 2. do 12. 3.

  • Vzorky byly ze všech 50 států USA a Jižní Koreje.
  • 55 % vzorků pocházelo od psů, 41 % od koček a 4 % od koní.
  • 77 % vzorků bylo z respiračního traktu, 23 % z výkalů.

 

Literatura

  1. Centers for Disease Control and Prevention, Division of Viral Diseases. CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Instructions for Use. CDC publication CDC-006-00019, Revision: 02. www.fda.gov/media/134922/download. Platnost k 15. březnu 2020. Stránka otevřena pondělí 16. března 2020.
  2.  Centers for Disease Control and Prevention, Division of Viral Diseases. Research Use Only Real-Time RT-PCR Protocol for Identification of 2019-nCoV. www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-detection-instructions.html. Aktualizováno 14. března 2020. Stránka otevřena pondělí 16. března 2020.